l
l Модел на електрофореза на колаген след изсоляване.
Ензимната екстракция означава, че след екстрахиране на разтворим колаген и киселинноразтворим колаген е необходимо някои протеази, като колагеназа, пепсин, папаин и химотрипсин, да бъдат хидролизирани, за да се получат различни ензимно разтворими колагени. Използваните протеази се разделят основно на 3 типа: животински протеази (като трипсин, пепсин), растителни протеази (като папаин, бромелаин) и микробни протеази (като алкални протеази, неутрални протеази). В изследванията върху ензимната хидролиза на колагена най-използвана е алкалната протеаза.
Колагенът се разгражда по ограничен начин, т.е. крайният пептид се разцепва. Тъй като ковалентните връзки между колагеновите пептидни вериги се образуват от взаимодействието на лизин или хидроксилизин в молекулния краен пептид, крайният пептид се разцепва. Основната част, съдържаща структурата на тройната спирала, може да бъде разтворена в разредени органични киселини и екстрахирана. Ензимното лечение може да хидролизира крайния пептид на колагеновия фибрин, да подобри добива на колаген; и няма да разруши структурата на тройната спирала на колагена и да запази неговите характеристики. Има много фактори, които влияят на ензимната екстракция, като концентрация на ензим, съотношение на ензим към субстрат, време на ензимна хидролиза, температура на ензимна хидролиза, стойност на pH и съотношение материал-течност. При реална работа по-голямата част от колагена се извлича чрез метода на ензимното съединение, а повече се извлича чрез пепсин, а органичната киселина е предимно оцетна киселина.
l Електроферограма на екстрахиран с пепсин колаген
Процесът на ензимна хидролиза на колаген се разделя главно на метод на едноензимна хидролиза и метод на мултиензимна хидролиза. Мултиензимният метод на хидролиза се разделя допълнително на метод на смесена ензимна хидролиза (като смес от говежди трипсин, проназа, бацилова протеаза) и метод на ензимна хидролиза стъпка по стъпка. Обикновено трябва да се разработи избор на специфичен експериментален процес и условия за ензимна екстракция на кожен колаген. За получаване на колагенови полипептиди с по-малки молекулни тегла обикновено се използва мултиензимна хидролиза. Основните фактори, влияещи върху ефекта на ензимолизата, са видът на ензима, количеството добавен ензим, температурата на ензимолизата, времето на ензимолизата, стойността на рН и съотношението на материала към водата. Използването на ензимна екстракция на колаген в агрегат може не само ефективно да съкрати времето за екстракция, но и да получи колаген с добра биологична активност, а замърсяването на околната среда също е малко. Колагенът не се хидролизира лесно от обикновена протеаза, но може да бъде разбит от животинска колагеназа, а счупените фрагменти могат да бъдат хидролизирани от обикновена протеаза след автоматична денатурация. Подходящите условия за пепсин да хидролизира колагена са pH 1.65-1.70 и температура 37 градуса.
Някои хора използват свински кости като суровини и използват реакцията на ензимна хидролиза на протеаза, за да заменят традиционния процес на производство на лепило и провеждат експериментални изследвания върху реакцията на ензимна хидролиза на колаген и процеса на ензимно производство на лепило. Резултатите показват, че пепсинът има най-висока степен на извличане на колаген (46,14 процента), следван от трипсин (43,42 процента), неутрална протеаза (30.14 процента) и алкална протеаза (21,15 процента). Основните влияещи фактори в реакцията на ензимна хидролиза на пепсин бяха оптимизирани чрез еднофакторни и ортогонални експерименти. Резултатите от теста показват, че оптималните условия за екстракция на пепсин са, че концентрацията на пепсин е 1 процент, ензимната хидролиза се извършва при pH 2,0 за 48 часа и след това се осолява в разтвор на NaCl с концентрация 10 процента (w/v ) за 24 часа. Крайната степен на възстановяване на колагена е 64,77 процента, а степента на извличане на колаген е 49,75 процента. Някои хора също са използвали пепсин за извличане на колаген от свинска кожа и са хидролизирали четири различни дози пепсин (1 процент, 2 процента, 2,5 процента, 3 процента) вземане на проби и тестване, уравнението на HILL от първи ред е използвано за симулиране на процеса на извличане на пепсин от колаген от свинска кожа и процеса на разпадане на скоростта на хидролиза на пепсин и накрая беше получена степента на екстракция на 2 процента доза пепсин и 6-7h време на хидролиза. максимум. Някои хора използват прясна свинска кожа като суровина, хидролизират с трипсин при условие 50-52 степен, дозировката на ензима е 5000:1 ~ 10000:1, стойността на pH е 9, реакцията е 2-3 ч, суровината: водата е ензимна хидролиза при условия 1:2. Резултатите показват, че степента на извличане на общия протеин е по-голяма или равна на 80 процента.
l Скорост на възстановяване на колаген в кожата на калмари от пепсин при променлива температура.
Когато се използва ензимен метод за извличане на колаген, условията за извличане трябва да бъдат строго контролирани:
Първо, времето за действие на ензима трябва да е подходящо. Ако времето е твърде кратко, колагенът няма да бъде напълно освободен в екстракта, което ще повлияе на скоростта на екстракция; ако времето за действие на ензима е твърде дълго, колагенът ще се хидролизира прекомерно, което ще доведе до твърде много горчив олигопептид с малка молекула, което не само ще повиши ефективността на разделяне и пречистване. Трудността също засяга функционалните свойства и биологичната активност на колагена.
Второ, температурата на ензимната хидролиза трябва да е подходяща. Ако температурата е твърде ниска, ефектът на ензима не е очевиден; ако температурата е твърде висока, това ще доведе до инактивиране на ензима и денатуриране на колагена. Според докладите, когато pH на средата е малко по-ниско от неутрално, температурата на денатурация на колагена е 40-41 градуса, когато pH на средата е кисела, температурата на денатурация на колагена е 38-39 градуса , а температурата на денатурация на колаген от рибена кожа е 7-12 градуса по-ниска от температурата на денатурация на колаген от свинска кожа. Следователно, ако екстрахираният колаген трябва да има добра биологична активност, температурата на екстракция трябва да бъде по-ниска от температурата на денатурация по време на процеса на екстракция.
Трето, трябва да се избере подходящият ензим. Като цяло, когато се извлича колаген от тъкан на сухоземни бозайници, е разумно да се използва пепсин за извличане при неговата оптимална температура, но за водни животни, като риба, температурата на денатурация на колагена е по-ниска от тази на сухоземните бозайници. Следователно много протеази не са подходящи и някои функционални свойства и биологични активности на колагена могат да бъдат унищожени, ако се екстрахират при оптимална температура за тези ензими. Изследванията върху извличането на колаген и неговите полипептиди чрез ензимни методи са основно от животински кожи и техните странични продукти и има малко доклади за използването на ензимни методи за извличане на колаген и неговите полипептиди от животински кости.
